The pathogenesis-related protein PR-4 from Theobroma cacao has antifungal activity and induces ROS in Moniliophthora perniciosa : S03O02

The pathogenesis-related proteins class 4 (PR-4) are known to be involved in plant defense response and/or related stress situations. The objective of this study was to evaluate the antifungal activity and reactive oxygen species (ROS) production of the TcPR-4b protein in Moniliophthora perniciosa. The TcPR-4b gene was cloned into pET28a and the resulting in frame fusion plasmid was used to transform Escherichia coli Roseta (DE3) for protein expression. The expression of the TcPR-4b recombinant protein was induced by 0.4 mM isopropyl-?-D-thio-galactoside and purified by immobilized metal affinity chromatography with TALON® Metal Affinity Resin. The TcPR-4b protein was used for in vitro assays against dikaryotic M. perniciosa broken hyphae. Then, 1 ml of the broken hyphae suspension was incubated for 2h with: i) 10 ?g of TcPR-4b in phosphate buffer (PB); ii) 20 ?g of TcPR-4b in PB; iii) 40 ?g of TcPR-4b in PB; iv) PB (control). Then, 1 ml of each treatment was applied on CPD solid medium (2% glucose, 2% peptone, 2% of agar) and incubated for 7 days at 25°C. The inhibition of hyphal growth was examined by counting the number of pseudo-colonies on three experimental replicates. To detect the production of the ROS in living cells of M. perniciosa, 1 ml of hyphae suspension was treated with 10 ?g of TcPR-4b in PB (or not - control) overnight at 25ºC, and then incubated at 25°C for 30 min with dihydroethidium which selectively stains the mitochondrial superoxide (O2 -). The hyphae were mounted on slides and observed under fluorescence microscope DMRA2 (Leica). Images were captured under fluorescent filters using the IM50 software (Leica). The reduction of M. perniciosa survival was observed in all tested concentrations of TcPR-4b with a decrease of survival correlated to the increase of the protein concentration. The hyphae treated with TcPR-4b presented a bright red fluorescence with specific more intense fluorescence in some foci. The control did not present fluorescence emission comparing to the hyphae treated with TcPR-4b. This study showed the antifungal activity of TcPR-4b and the induction of ROS in M. perniciosa. Work supported by CNPq, FAPESB, FINEP/RENORBIO, CAPES, Cirad. (Texte intégral

Les mutations de la protéines TCPR-10 n'inhibent pas l'activité de la rhibonucléase ni son activité antifongique

La protéine 10 (TcPR-10) liée à la pathogénèse, obtenue à partir d'une bibliothèque l'interactions Theobroma cacao - Moniliophthora pemiciosa, présente une activité antifongique contre ce champignon et agit aussi in vitro en tant que ribonucléase. Toutefois, malgré son intérêt biotechnologique, la protéine TcPR-10 présente un potentiel allergénique. L'insertion de mutations dans le motif responsable du potentiel allergénique de la protéine TcPR10 peut produire des protéines avec un pouvoir allergénique réduit. L'objectif de la présente étude était de vérifier les changements potentiels dans la fonction catalytique de la protéine TcPR-10 dus à l'insertion de substitutions de nucléotides. Des mutants de substitution (Thr10Pro, IIe30Val, His45Ser) ont été insérés dans le gène TcPR-10 par rnutagenèse dirigée par extension de recouvrement basée sur une réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Le produit a été cloné dans un vecteur pET28a et exprimé dans des cellules Escherichia coli BL21 (DE3). L'activité de la ribonucléase a été vérifiée en incubant un microgramme d'ARN avec la protéine mutante TcPR-10 (1 µg) à 25 oc à différents moments (à 10 minutes, 20 minutes, lh, 2h et 3h). Le contrôle positif a utilisé la protéine de type sauvage TcPR-10 précédemment caractérisée par l'activité de la riboonucléase. L'activité de la ribonucléase a été déterminée par dégradation totale de l'ARN observée dans 1% de gel d'agarose. L'activité antifongique des protéines mutantes TcPR-10 a été déterminée en inhibant la croissance des hyphes dicaryotiques brisées de M perniciosa en utilisant des concentrations croissantes des protéines recombinantes (0, 4, 8 et 10 µg/plaque). L'incubation de la protéine TcPR-10 mutante avec l'ARN de M pemiciosa à 25°C à différents moments montre que, bien qu'il y ait eu une légère réduction du taux de dégradation, les insertions n'ont pas altéré l'activité de la protéine ribonucléase. La survie du champignon bais au fur et à mesure que la concentration de la protéine mutante TcPR-10 augmente, faisant apparaître le même profil que celui observé pour la protéine sauvage. Avec une concentration de 8 mg/mL, la protéine sauvage de TcPR-10 montre un taux d'inlubition de la croissance de 73% pour le champignon, et de 61% pour la protéine mutante TcPR-10, sans différence statistique eriire les valeurs (p>0,05; test de Tukey). L'effet in vitro de la protéine mutante TcPR-10 sur la survie de M pemiciosa montre que les changements n'inhibent pas l'activité antifongique de la protéine. En conclusion, les protéines mutantes ne présentent pas de perte des propriétés biotechnologiques intéressantes. (Résumé d'auteur

Physiological and molecular responses of diploid and tetraploid Carrizo Citrange under water Stress : S02P14

In citrus, the use rootstock promotes productivity, improves fruit quality and may confer resistance or tolerance to biotic and abiotic stress. 'Carrizo' citrange (Citrus sinensis [L.] Osbeck × Poncirus trifoliata [L.] Raf), is one of the most popular rootstock in the Mediterranean basin. It is sensitive to drought and salt stress but confers tolerance to Tristeza virus, and promotes very good fruit quality. Previous studies have shown that doubled diploid (4x) 'Rangpur' lime (Citrus limonia, Osbeck) seedlings are more tolerant to water deficit than their respective diploid (2x). In the present work, we have characterized the water deficit tolerance in 2x and 4x 'Carrizo' citrange seedlings. Water deficit was applied for 35 days, followed by irrigation. Several physiological parameters were measured periodically during the experiment and samples were collected to investigate i) the activity of enzymes involved in detoxification processes, ii) the expression analysis of candidate genes involved in ABA biosynthesis, as well as iii) ABA and H2O2 production. Doubled diploid 'Carrizo' citrange seedlings were showed to be more drought tolerant than 2x. Water deficit caused a greater reduction in photosynthetic rates and stomatal conductance in 2x compared to 4x. Also higher ABA and H2O2 production were induced in 2x when compared to 4x. The better tolerance of 4x seedlings is discussed to the light of candidate genes expression analysis and activities of enzymes of detoxification. Work supported by CNPq and CAPES. (Texte intégral

Action of the pathogenesis-related protein PR10 from Theobroma cacao in triggering response mechanisms of Moniliophtora perniciosa

Cacao (Theobroma cacao L.) is an important commodity worldwide, but its production is limited by destructive diseases such witches' broom, due to the fungus Moniliophthora perniciosa. The high recombination rate and genetic variability of this fungus promoted resistance breakdown of cacao and annihilated the efforts made by the Brazilian government to reduce the disease impact on plantations. According to the literature, pathogenesis related-proteins (PRs) plays an important role in defense/resistance mechanisms of the plant submitted to various biotic and abiotic stresses. A cDNA clone encoding a PR10 (named TcPR10) was obtained from a cacao-M. perniciosa EST library. The corresponding recombinant protein (expressed in Escherichia coli BL21(DE3)) present a strong antifungal activity against M. perniciosa, as previously demonstrated. In this work, we developed a proteomic analysis of the fungus cultivated in the presence of TcPR10, using 2DE-MS/MS. M. perniciosa was grown in CPD 2% agar medium; after 15 days, the fungal hyphae were broken and were grown in presence of 3 ?g/mL of TcPR10 for 1h.Then, the total proteins were extracted using the ADP method, followed by a simple cleaning using the method of SDS-dense and phenol. The quantification was made using a 2-D quantification kit. The proteins were extracted in triplicate and separated using a 12% bi-dimensional SDS-PAGE gel. The 2D map analysis showed approximately 300 "spots" per gel (control and one hour treatment) with differential protein expression pattern. The analysis using a mass spectrometry (naniESI-Q-TOF) was made for the identification of the spots. We identified several proteins involved in fungal metabolism, carbohydrates/proteins metabolism, related proteins to growth and phytotoxics proteins. More spots have been identified to better understand the mechanism of fungi response to protein PR10. (Texte intégral

Dual enzymatic activity of the pathogenesisrelated protein TcPR-4 from Theobroma cacao: ribonuclease and Ca+2 and Mg+2 dependent deoxyribonuclease activities

The class 4 pathogenesis-related proteins (PR4) are classified as chitinases and contain a conserved Barwin domain. The TcPR-4b cDNA identified from a library of Theobroma cacao L. pod (genotype TSH1188) infected by Moniliophthora perniciosa also presents the Barwin domain with six conserved cysteine residues, but lacks the chitin-binding site and for this reason was classified as class II PR4. The TcPR-4b gene was cloned into pET28a and the resulting in frame fusion plasmid was used to transform Escherichia coli Roseta (DE3) for protein expression. The expression of the TcPR-4b recombinant protein was induced by 0.4 mM isopropyl-?-D-thio-galactoside and purified by immobilized metal affinity chromatography with TALON® Metal Affinity Resin. To determine the DNase activity of the purified recombinant TcPR-4b protein, 1 ?g of purified pGEM-T® Easy Vector DNA was incubated with different protein amounts (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 ?g) in the presence or absence of 10 mM of MgCl2 or 1 mM of CaCl2 overnight at room temperature. RNase activity of recombinant TcPR-4b was performed using different protein amounts (5, 10, 15, 20 and 25 ?g) incubated for 30 min with 5 ?g of RNA extracted from Solanum lycopersicum leaves. The reaction products were analyzed in 1.5% agarose electrophoresis gel. The TcPR-4b protein recombinant showed both DNase and RNase activity. DNase activity was observed only in the presence of Mg+2 and Ca+2 ions. The results of this study suggest that TcPR-4b may act as nuclease during the infection of cacao plants with M. perniciosa. Financial Support: CNPq, BNB, FINEP/RENORBIO, CAPES. (Résumé d'auteur

Proteomic profile of the fungus Moniliophthora perniciosa in response to PR10 from Theobroma cacao : [Abstract R9140]

Witches' broom disease is caused by the hemibiotrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa. This pathogen is the main cause of the decline in cocoa production, and consequently of social, economic and environmental problems. The transcriptomic program of cacao allowed the identification of a pathogenesis-related 10 protein. The corresponding recombinant protein expressed in Escherichia coli BL21 showed a strong antifungal activity in vitro against M. perniciosa. Here, we developed a proteomic analysis of M. perniciosa proteins expressed in the presence of recombinant TcPR10. M. perniciosa was grown in CPD 2% agar medium; after 15 days, the fungal hyphae were broken and were brought together with 3 ?g/mL of TcPR10 for 1h. After this time, the total proteins of the hyphae were extracted using the ADP method, followed by a simple cleaning using the method of SDS-dense and phenol. The quantification was made using a 2-D quantification kit. The proteins were extracted in triplicate and separated using a 12% bi-dimensional SDS-PAGE gel. The 2D map analysis showed approximately 300 "spots" per gel (control and one hour treatment) with differential protein expression pattern. The analysis using a mass spectrometry (naniESI-Q-TOF) was made for the identification of the spots. We identified several proteins involved in fungal metabolism, carbohydrates/proteins metabolism, related proteins to growth and phytotoxics proteins. More spots have been identified to better understand the mechanism of fungi response to protein PR10. (Résumé d'auteur

Etudes in silico et in vitro des polyganaturonases de Moniliophthora Perniciosa

Les pectinases consùtuent un groupe d'enzymes qui se dégradent en substances pectiques, hydrolysant les liaisons glycosidiques tout au long de la chaîne carbonée. Elles sont produites par les plantes, les champignons filamenteux, les bactéries et les levures. Ces enzymes ont un rôle important: i) dans la physiologie végétale, ii) dans les microorganismes pathogènes agissant comme un facteur de virulence pendant l'infection de la plante; iii) dans les industries agro-alimentaire, du textile et du papier. Des gènes homologues des polygalacturonases (PG, EC 3.2.1) ont été identifiés dans la base de données génomique du champignon Moniliophthora perniciosa, l'agent pathogène de la maladie des balais de sorcières du cacaoyer (Theobroma cacao L.). Nous avons réalisé une caractérisation in silico des gènes de polygalacturonase (PG) de M. pemiciosa et nous avons évalué leur expression dans le champignon cultivé dans un système artificiel (cookies) ainsi que dans un milieu de culture contenant différentes sources de carbone. Trois gènes PG ont été identifiés (PG1, PG2, PG3) et caractérisés in silico par analyse de séquence, alignement de séquence. construction de cladogramme et conception d'amorces pour l'étude de l'expression des gènes par PCR en temps réel (RT-qPCR), en utilisant différents logiciels. Pendant la croissance de l'agent pathogène sur les cookies, quatre étapes de développement ont été observées en fonction de la couleur du mycélium (blanc, jaune, rose clair et rose foncé). L'analyse par RT-qPCR a montré que l'expression était supérieure dans la phase jaune, suivie par la phase rose foncé et la phase rose clair. respectivement, pour les trois gènes PG. L'expression des gènes a aussi été analysée sur l'agent pathogène cultivé dans un milieu liquide contenant différentes sources de carbone (D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-mannitol, D-sucrose, D-fructose et glycérol). Dans cette étude, nous avons observé que le gène PG2, suivis par le gène PGl, étaient ceux avec l'expression la plus élevée quand le champignon était cultivé dans un milieu contenant du D-mannose. Quand le champignon a été cultivé dans du D-galactose, les trois gènes étudiés ont présenté une expression significative. PG3 obtenant l'expression la plus élevée et PG2 la plus faible. Dans le D-mannitol, seul le gène PG2 a présenté une expression, les autres gènes ont été réprimés. Dans le D-sucrose, les gènes PG1 et PG2 ont montré une faible expression, et dans le D-fructose et le glycérol, nous avons observé une répression de tous les gènes étudiés. Nous pensons que cette étude peut servir à l'élaboration de différentes stratégies de lutte contre la maladie et également à une production à grande échelle de pectinase destinée à être utilisée dans le secteur des biotechnologies. (Résumé d'auteur